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盘式过滤机-PAGE凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度关系

时间:2019-07-17 查看:171
内容摘要:水稻根蛋白质的银染结果 (V)在显色液中显色,直到蛋白带清晰为止。 ( Vi )用 ddH 2 0冲洗,终止反应(结果见图6-3)。 三、未知蛋白质样品分子量的测算 1 . 蛋白质 Marker 图6-4中共有六条蛋白带。由迁移速率与分子量之间的关系可知,在某一个 泳道中,蛋白带...
水稻根蛋白质的银染结果
(V)在显色液中显色,直到蛋白带清晰为止。
(Vi)用ddH20冲洗,终止反应(结果见图6-3)。
三、未知蛋白质样品分子量的测算
1.蛋白质Marker
图6-4中共有六条蛋白带。由迁移速率与分子量之间的关系可知,在某一个 泳道中,蛋白带的分子量从上到下逐渐变小。在电泳实验中,经常要将一种蛋白 Marker和我们的样品一同上样。所谓Marker,就是一系列分子量已知的蛋白样 品,用来获取制作标准曲线的参数。蛋白Marker—般由各公司提供,图6-4为
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第六章蛋白质电泳技术
兔磷酸化酶B
牛血清蛋白 兔肌动蛋白
牛碳醸酐痛
胰蛋白酶抑制剂 鸡蛋淸溶菌酶
相对迁移率(MR)
图6-5标准曲线的制作
由于蛋白质的分子量越大,其迁移速率相对越小,所以标准曲线的斜率一定 是单调递减型的。
一种常用的商品Marker
兔磷酸化酶B (97 400)
一牛血淸白蛋白 (66 200)
兔肌动蛋白 (43 000)
牛磷酸酐酶 (32 000)
—胰蛋白酶抑制剂 (20 100)
一鸡蛋清溶苗酶 (14 400)
图6-4 —组常见的低分子蛋白Marker,分子量的单位是Da
2. 相对迁移率的计算
在剥胶时需要测量一下溴酚蓝迁移的距离。这是计算相对迁移率必不可少的 数据之一。对于凝胶厚度在1mm以下的电泳实验,可用下式计算相对迁移率
(MR): MR =蛋白带迁移距离:溴酚蓝迁移距离
3. 标准曲线的绘制
以每条Marker带的相对迁移率为横坐标,相应分子量的对数值为纵坐标, 绘制标准曲线。如图6-5所示。
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实验23 SDSPAGE和蛋白分子量的测定
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4.未知蛋白质样品分子量的测算
计算未知蛋白质样品的相对迁移率,在标准曲线上找到对应的纵坐标,即可 得该样品的分子量。如图6-6所示。未知蛋白质样品分子量的测算
四、思考题
1. 请思考PAGE凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度关系?
2. 依据SDS的作用原理,请思考计算所分离出的蛋白带的分子量是天然蛋白质 的分子量吗?
3. 在SDS^PAGE测定蛋白质分子量时,必须加入过量的SDS和巯基试剂,为什 么?
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第六章蛋白质电泳技术
实验24 IEF-SDS双向凝肢电泳
双向凝胶电泳的分离系统是依据蛋白质分子两个独立的不同的物理参数对蛋 白质分子进行分离的。第一向是根据不同蛋白质分子所带电荷的差异,以等电点 聚焦(isoelectric focusingIEF)技术进行分离。第二向是根据蛋白质分子质量 大小的不同,通过SDSPAGE凝胶电泳进行分离。由于这两个参数互不相关, 因此在最后的凝胶上可获得分辨率很高的蛋白质二维图谱。
在第一向等电点聚焦电泳中,蛋白质分子在不同的pH环境中带不同数量的 正电荷或负电荷,当在某一 pH时,蛋白质的净电荷为零,此PH即为该蛋白质 的等电点(isoelectric point, pi)。蛋白质的等电点仅取决于它的氨基酸组成,因 此每一种蛋白质都有其各自的等电点。利用IEF技术就可以进行蛋白质的分离 和分析。
本实验第一向所用的聚焦载体为固相pH梯度,它的介质是一些具有弱酸或 弱碱'ft质的丙烯酰胺衍生物,它们与丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺具有相似的聚合 性质,能形成稳定的不随环境电场等条件变化的pH梯度。由Pharmacia公司生 产的IPG介质商品名为ImmobilineImmobiline分子的一端是双键,在聚合过程 中通过共价结合嵌合到聚丙烯酰胺介质中;另一端是一个缓冲基团RR为弱酸 或弱碱,它可在聚合物中形成弱酸或弱碱的缓冲体系。固相pH梯度凝胶可以由 二组一系列不同pK值的Immobiline与丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺按不同比例经 梯度混合,Immobiline共价结合到丙烯酰胺凝胶中,形成固相pH梯度凝胶。它 的特点是pH梯度稳定,不受脱水、重新水化和电场因素的影响,平衡蛋白质不 易被洗脱,易进入第二向凝胶,因此IEF-SDS凝胶双向电泳分析,是目前分离 蛋白质的最好方法,已成为蛋白质组学研究不可缺少的核心技术。
—、材料、试剂与仪器
1. 材料水稻根、叶可溶性蛋白
2. 试剂
(1) 预制胶条(IPG),简称干胶条。可根据实验需要选择不同PH范围和长 度的干胶条,从Amersham Phamacia Biotech公司和BIORAD公司订购。
(2) 裂解液 8mol/l 脲,4 % CHAPS, 40mml/l Tris - 20t:保存。
(3) 水化液8mol/l脲,2%CHAPS,溴酚蓝(微量)-2(TC保存。在使用 时,每2.5ml加7mgDTT,现用现加。
⑷样品溶液8mol/l脲,2% CHAPa .IPG缓冲液0.5%或2% (依据干胶 条的长度和pH范围选定,见表6-2)溴酚蓝(微量)-201C保存,可保存2个月。
实验24 IEF-SDS双向凝胶电泳
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(5) 平衡液贮液 50mmol/l Tris^l pH 8.8,6mol/l 脲,30% 甘油,2% SDS,溴酚蓝微量。
平衡液A:取平衡液贮液15ml加30mg DTT 平衡液B:取平衡液贮液15ml加450mg碘乙酰胺
加有脲的试剂均应避免过高的温度处理,一般不要超过30X:,否则脲分解 产生异硫氰酸盐会引起氨基甲酰化而导致电荷不均一性。
(6) IPG缓冲液pH3-10 (与实验要求一致)
(7) 凝胶贮液30%丙烯酰胺,0.8%甲叉双丙烯酰胺
(8) 4 x 分离胶缓冲液 1.5mol/l Tris-Cl pH8.8
(9) 10% SDS
(10) 凝胶洗涤液 0.375mol/lTris-ClpH8.8, 0.1%SDS,贮存
(11) 303电极缓冲液25〇1111〇1/11'1^’1921111〇1/1甘氨酸,0.1%303
(12) 琼脂糖封胶液0.5%琼腊糖溶于SDS电极缓冲液,微量溴酚蓝。
(13) 银染液
5%AgN〇3溶液:AgN〇3 5g溶解后,定容至100ml,置棕色瓶中保存。
10%硫代硫酸钠溶液:10g硫代硫酸钠溶解后,定容至100ml
25%戊二醛溶液(分析纯),38%甲醛溶液(分析纯)。