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盘式过滤机-千胶条重新水化示意图第六章蛋白质电泳技术

时间:2019-07-17 查看:114
内容摘要:仪器与器皿 取液器(20f4、2004、 lOOOjul )、配套吸头、1.5 ml 离心管、表面皿、弯头 镊、染色盘、一次性手套、水化胶条盘、 Mukiphor-n 电泳单元、 EPS 3 500电 源、循环水浴设备、 Protean II XiCell 垂直电泳系统、脱色摇床等 二、实验操作 1.固相pH梯度...
仪器与器皿
取液器(20f4、2004、lOOOjul)、配套吸头、1.5ml离心管、表面皿、弯头 镊、染色盘、一次性手套、水化胶条盘、Mukiphor-n电泳单元、EPS 3 500电 源、循环水浴设备、Protean II XiCell垂直电泳系统、脱色摇床等
二、实验操作
1.固相pH梯度等电聚焦凝胶电泳(第一向)
(1) 样品的准备:将水稻根、叶可溶性蛋白溶入一定量的裂解液中,裂解后 再加入2倍量的样品溶解液,使样品充分溶解,离心lOOOOrpm, 5min取上清于
另一离心管中。
(2) 干胶条的重新水化(泡胀,表6-2,表
6-3),将保存在-2(rc冰箱中18cmpH3~10的 干胶条取出,在室温下平衡,每个胶条加水化液 总体积量为3504 (包括使用前加入的IPG缓冲 液7^1)。当样品采用泡胀加入时,样品5〇4,水 化液量应为300从将两种液体混合后加入水化 槽中,干胶条去掉保护膜,胶面朝下放入水化槽
(图6-7)中,上面慢慢滑动加入一层2ml石蜡图6-7千胶条重新水化示意图第六章蛋白质电泳技术
油,盖好盖子室温下静S过夜水化约16hr(
表6-2 IPG胶条长度与水化液体积表
胶条长度CJT :« 每条-水化液体积
7 125
11 200
13 250
18 350
24 450
*如果水化时加入样品,此体积是加入样品后的终体积。(参照Amersbam Phamacia公司2-DE操作指南)
表6-3重新水化1PG缓冲液的添加董
1EF系统 IPG胶条的pH范围 IPG缓冲液的pH范围 推荐浓度
MuhiphorU 4-7L*,3〜10L,或3〜10NL” iPG缓冲液与IPG胶条的PH范2%IPG缓冲液
围一致
Multiphor II 6-ilL pH 6〜UL 1PG缓冲液 0.5% IPG缓冲液
IPGphor 4〜7U 3〜:iOL,3〜10NL或IPG缓冲液与IPG胶条的pH范 0.5% IPG缓冲液
 6 〜11L  围一致  
*Hne,线性;* * NL^nonline,非线性。(参照 Amersham Pbamada公司 2-DE操作指南)
⑶开启循环水,使Multiphor II温度恒定为20X:。
(4) 塑料沟槽板的安放:在Multiphor II的平台上滴加3~4ml石蜡油,在 冷却板上涂匀放上电泳池,连接电极接头;再吸取约lml石蜡油在电泳池中涂 匀,将塑料沟槽板安放在上面,排除两者之间的气泡。
(5) 取出已水化过的胶条,用双蒸水冲洗掉多余的水化液,以滤纸轻轻吸去 水分,将胶条放入塑料沟槽的沟槽中,胶面朝上,注意胶条的酸性端要朝向阳极 接头(见图6-8)。将电极滤纸条剪成各120mm长的两截小条,放在一干净玻璃 板上,其中一个加入约0.5mkldH2O,放在胶条的阳极端;另一条滤纸要加入 2()mmol/lDTT浸泡,放在胶条的阴极端。IPG胶条放入Multiphor II内的示意图
实验24 IEF-SDS双向凝胶电泳
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(6) 加上正极(红色)和负极(黑色)杆,使其铂金丝压在电极纸条上。
(7) 加入70~80ml石蜡油完全覆盖住胶条。
(8) 连接电极,开循环水冷却,使温度保持20X:,打开EPS 3500电源,参 考表6-4程序参数进行电泳操作。
6-4 Multiphor I IEF的搡作参数表
1PG胶条阶段电压/v 电流/mA功率/界时间/111:111;11\〇11:(推荐)
长度 pH范围 1 200 2 5 0 01 1
7cm pH4~7L 2 3 500 2 5 1 30 2 800
    3 3 500 2 5 0 551:30 3 200 〜5 200
            2 253:00 6 000 〜8 000
7cm *pH6~llL 1 200 2 5 0 01 1
  pH3~10L 2 3 500 2 5 1 30 2 800
  pH3-10NL 3 3 500 2 5 0 351:05 2 200~3 700
            2 052:35 5 000 6 500
11cm *pH4~7L 1 300 2 5 0 01 1
    2 3 500 2 5 1 30 2 900
    3 3 500 2 5 2 203:30 8 100~12 100
            3 505:00 11 000-15 000
11cm *pH6 11L 1 300 2 5 0 01 1
  pH3 10L 2 3 500 2 5 1 30 2 900
    3 3 500 2 5 1 452:35 6 100~9 100
            3 154:05 9 000~12 000
13cm *pH4~7L 1 300 2 5 0 01 1
    2 3 500 2 5 1 30 2 900
    3 3 500 2 5 3 45〜4:20 13 100〜18 100
            5 155:50 16 000~21 000
13cm *pH6 11L 1 300 2 5 0 01 1
  PH3-10L 2 3 500 2 5 1 30 2900
  PH3-10NL 3 3 500 2 5 3 104:00 11 100-14 100
            4 40〜5:30 14 000~17 000
18cm #pH4 7L 1 500 2 5 0 01 1
    2 3 500 2 5 1 30 3 000
    3 3 500 2 5 5 40〜7:40 20 000 - 27 000
            7 10 9:10 23 000- 30 000
18cm *pH6~llL 1 500 2 5 0 01 1
  pH3-10L 2 3 500 2 5 1 30 3 000
  PH3-10NL 3 3 500 2 5 4 506:20 17 000 ~ 22 000
6:20~ 7:50 20 000-25 000
当样品使用PH6~11LpH4~7LIPG胶条时,为了聚焦完全,建议增加伏特-小时vhr),7cm 长的IPG胶条延长6~ 10倍,lion长的IPG胶条延长5~8倍13和18cm长的IPG胶条延长5~7倍, 但不得超过100 000vhro (参照Amersham Phamacia公司2-DE操作指南〉